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磺胺五合一

快速檢測試劑盒說明書

一、原理

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物磺胺類藥物將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗磺胺類藥物抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物磺胺類藥物的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出相應(yīng)殘留物磺胺類藥物的含量。

二、試劑盒特性

• 試劑盒靈敏度：   1ppb
• 孵育溫度：       25℃
• 孵育時間：       30min~15min

u 樣本檢測下限

組 織（高 檢 測 限 方 法）  ·············   1ppb

組 織（低 檢 測 限 方 法）  ··············   5 ppb

蜂 蜜 ··············································   1ppb

血 清 、 尿 液  ······························   4 ppb

牛    奶  ······································   20 ppb

u 交叉反應(yīng)率

磺胺嘧啶（SD或SDZ）  ·····················  100.0%

磺胺間甲氧嘧啶/磺胺六甲氧嘧啶（SMM）····97.6%

磺胺甲噁唑（SMZ）  ····························  100%

磺胺噻唑（ST）  ································  195.0%

磺胺甲基嘧啶（SM₁ ）  ························   92%

u 樣本回收率

組  織 、尿 樣、牛 奶  ···············   85% ±25%

蜂 蜜、血 清  ···························   80% ±23%

三、試劑盒組成

四、所用儀器、試劑

具備的儀器：酶標(biāo)儀、均質(zhì)器、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）、氮吹儀、恒溫箱

微量移液器：單道 20~200µl、單道100~1000µl、多道 30~300 µl

試      劑：乙酸乙酯、乙腈、二氯甲烷、正己烷、Na₂HPO₄·12H₂O、一水合檸檬酸、濃鹽酸、NaOH

五、樣本前處理步驟

• 樣本處理前須知

（a）實驗中必須使用一次性吸頭，吸取不同試劑時要更換吸頭。

（b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結(jié)果。

• 樣本前處理需配制：

配液1   0.2M NaOH溶液

稱取0.8gNaOH用去離子水100ml溶解。

配液2   0.5M鹽酸溶液

4.3ml濃鹽酸加入去離子水定容至100ml混勻。

配液3   Na₂HPO₄-檸檬酸緩沖液

稱取19.85gNa₂HPO₄·12H₂O與9.3g一水合檸檬酸，加去離子水定容至1L混勻。

配液4   乙腈-二氯甲烷混合溶液：

         V_乙腈：V_二氯甲烷  =  1 : 4

配液5   樣本復(fù)溶液：

將20X濃縮復(fù)溶液用去離子水1：19稀釋。

• 樣本處理：

（a）組織高檢測限處理方法一

• 稱2.0±0.05g 均質(zhì)過的組織樣本于50ml離心管中；加入6ml乙酸乙酯，振蕩2min，4000r/min以上，15℃離心10min；
• 取3ml清澈有機相至干燥容器中，50-60℃氮氣或空氣吹干；
• 用1ml樣本復(fù)溶液溶解干燥的殘留物，加入正己烷1ml。混合30s，4000r/min以上15℃離心5min；去除上層正己烷；
• 取下層50µl液體用于分析。

樣本稀釋倍數(shù):  1倍 

（b）組織高檢測限處理方法二

1、稱2.0±0.05g 均質(zhì)過的組織樣本于50ml離心管中；

2、加入乙腈-二氯甲烷混合溶液8ml，振蕩5min，4000r/min以上，15℃離心10min；

3、取4ml有機相至干燥容器中，56℃氮氣吹干/旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干；

4、用1ml樣本復(fù)溶液溶解干燥的殘留物，加入正己烷1ml混合30s，4000r/min以上15℃離心5min；

5、去除上層正己烷，取下層50µl液體用于分析。

樣本稀釋倍數(shù)： 1倍 

   注：此方法與喹諾酮類組織前處理方法二合一。

（c）組織低檢測限處理方法

• 稱2.0±0.05g 均質(zhì)過的組織樣本于50ml離心管中；加入8ml 樣本復(fù)溶液，震蕩2min；4000r/min以上，15℃離心10min；
• 取50µl液體用于分析。

    樣本稀釋倍數(shù):  5倍 

（d）血清處理方法

• 將血樣本于室溫放置30min，于10℃，4000r/min以上離心10min，分離出血清或過濾血清；
• 取1ml血清，加入3ml 樣本復(fù)溶液混合，混合30s；
• 取50µl液體用于分析。

樣本稀釋倍數(shù):  4倍 

（e）蜂蜜處理方法

• 稱取1±0.05g蜂蜜樣本于50ml離心管中，加入1ml 0.5M 鹽酸溶液置于37℃環(huán)境中30min；
• 分別加入2.5ml 0.2M NaOH溶液和3ml Na₂HPO₄-檸檬酸緩沖液，再加入4ml乙酸乙酯振蕩2min，4000r/min以上室溫離心10min；
• 取2ml上層有機相于50-60℃下氮氣吹干，加入0.5ml 樣本復(fù)溶液復(fù)溶，混合30s；

4、 取50µl液體用于分析。

樣本稀釋倍數(shù):  1倍  

（f）尿液處理方法

• 用3ml樣本復(fù)溶液與1ml經(jīng)離心后的清亮尿樣本混合，混合30s；
• 取50µl液體用于分析。

樣本稀釋倍數(shù):  4倍

（g）牛奶處理方法

• 取1ml牛奶樣本用樣本復(fù)溶液按1︰19（v/v）稀釋（即20µl牛奶+380µl 樣本復(fù)溶液），混合30s；
• 取50µl液體用于分析。

樣本稀釋倍數(shù):  20倍

六、 酶標(biāo)免疫分析程序:

• 測定前應(yīng)須知：

• 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫（20～25℃）。
• 使用之后立即將所有試劑放回2～8℃。
• 在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點。
• 所有恒溫孵育過程，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。

• 操作步驟：

• 從2～8℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，室溫（20～25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
• 取出框架及需要數(shù)量的微孔，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。
• 配液：將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。
• 編號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。
• 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣品50µl/孔到各自的微孔中，加入酶標(biāo)記物50µl/孔，然后再加入抗體工作液50µl/孔，用蓋板膜封板，25℃環(huán)境中反應(yīng)30min。
• 將孔內(nèi)液體甩干，用已稀釋的洗滌液250µl/孔洗板4～5次，每次間隔15～30秒，用吸水紙拍干（拍干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
• 顯色：加入底物A液50µl/孔，再加入底物B液50µl/孔，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境中避光顯色15min。
• 測定：加入終止液50µl/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，5min內(nèi)讀數(shù)），測定每孔OD值。

七、結(jié)果判定

結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光度值與其所含磺胺類藥物量成負(fù)相關(guān)。

1、粗略判定：

用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.3，樣本2的吸光度值為1.0，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：0ppb為2.243； 1ppb為1.816；3ppb為1.415；9ppb為0.74；27ppb為0.313；81ppb為0.155。則樣本1的濃度范圍是27ppb～81ppb；樣本2的濃度范圍是3ppb～9ppb，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中磺胺類藥物實際濃度。

2、定量分析

（1）百分吸光率的計算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的吸光度值的平均值（雙孔）除以第-—個標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以100%，即

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ng/ml）的半對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中磺胺類藥物實際濃度。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。

八、 注意事項

• 室溫低于25℃或試劑及標(biāo)本未回到室溫（20～25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。
• 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會伴隨著標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進行下一步操作。
• 混合要均勻，否則會出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。
• 反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。
• 不要使用過了有效日期的試劑盒；稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值變化；不要交換使用不同批號的盒中試劑。
• 不用的微孔板放進自封袋重新密封；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。
• 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。標(biāo)準(zhǔn)品1的吸光度值小于0.5時，表示試劑可能變質(zhì)。
• 該試劑盒*反應(yīng)溫度為25℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

九、儲藏條件和保質(zhì)期

• 儲藏條件：試劑盒于2～8℃保存，不要冷凍。
• 保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見包裝盒。

提示：酶標(biāo)板真空包裝袋若有漏氣，酶標(biāo)板仍然正常有效，不影響實驗結(jié)果，請放心使用。

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